3/1 :20247

2.2.47. КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ

Капиллярный электрофорез представляет собой физический метод анализа, основанный на

миграции внутри капилляра заряженных частиц определяемых веществ, растворенных в

растворе электролита, под действием электрического поля постоянного тока. Скорость

миграции частиц определяемого вещества в электрическом поле с напряженностью Е

определяется их электрофоретической подвижностью и электроосмотической подвижностью

буферного раствора внутри капилляра. Электрофоретическая подвижность растворенного

вещества (µ

ср

) зависит от характеристик растворенного вещества (электрический заряд,

молекулярный размер и форма) и буферного раствора, в котором происходит миграция (тип и

ионная сила электролита, значение рН, вязкость и наличие добавок). Электрофоретическую

скорость (ν

ср

) растворенного вещества, частицы которого принимаются за сферические,

описывают уравнением:

ер

= µ

ер

× Е = 󰇣





󰇤  󰇣





󰇤

Когда капилляр, заполненный буферным раствором, помещают в электрическое поле, внутри

капилляра начинается перемещение растворителя, называемое электроосмотическим

потоком. Скорость электроосмотического потока зависит от электроосмотической

подвижности (µ

ео

), которая, в свою очередь, зависит от плотности заряда на внутренней

стенке капилляра и свойств буферного раствора. Электроосмотическую скорость (ν

ео

)

описывают уравнением:

ео

= µ

ео

× Е =󰇣





󰇤  󰇣





󰇤

где:

ε – диэлектрическая постоянная буферного раствора;

ζ – дзета-потенциал поверхности капилляра.

Скорость растворенного вещества (ν) определяют как:

где:

q –

η –

r –

V –

L –

эффективный заряд растворенного вещества;

вязкость раствора электролита;

Стоксовский радиус растворенного вещества;

приложенное напряжение;

общая длина капилляра.

ν = ν

ер

+ ν

ео

В зависимости от заряда растворенного вещества его электрофоретическая подвижность и

электроосмотическая подвижность могут иметь одинаковое или противоположное

направление. При нормальном капиллярном электрофорезе анионы будут мигрировать в

направлении, противоположном электроосмотическому потоку, а их скорости будут меньше

электроосмотической скорости. Катионы будут мигрировать в том же направлении, что и

электроосмотический поток, и их скорости будут больше, чем электроосмотическая скорость.

В условиях, когда электроосмотическая скорость выше электрофоретической скорости

растворенных веществ, катионы и анионы могут быть разделены в одном прогоне. Время (t),

затрачиваемое растворенным веществом для миграции на расстояние (l) от инъекционного

конца капилляра до точки обнаружения (эффективная длина капилляра), определяют

уравнением:

Как правило, капилляры, изготовленные из плавленого кварца без покрытия со значением рН

более 3, имеют отрицательный заряд, обусловленный ионизацией силанольных групп,

расположенных на внутренней стенке капилляра. Соответственно, электроосмотический

поток направлен от анода к катоду. Электроосмотический поток должен оставаться

постоянным от прогона к прогону, чтобы получать надлежащую воспроизводимость скорости

миграции растворенных веществ. В некоторых случаях может быть необходимо уменьшить

или устранить электроосмотический поток путем модификации внутренней стенки капилляра

или путем изменения концентрации, состава и/или значения pH буферного раствора.

После введения испытуемого образца в капилляр, каждый ион определяемого вещества

мигрирует внутри фонового электролита как независимая зона, в соответствии с его

электрофоретической подвижностью. Дисперсия зоны, представляющая собой уширение

полосы каждого вещества, является следствием различных явлений.

В идеальных условиях единственный вклад в расширение зоны растворения вносит

молекулярная диффузия растворенного вещества вдоль капилляра (продольная диффузия). В

таком идеальном случае эффективность зоны, выраженная числом теоретических тарелок

(N), определяется как:

где:

D - коэффициент молекулярной диффузии растворенного вещества в буферном

растворе.

На практике другие явления, такие как рассеивание тепла, адсорбция образца на стенке

капилляра, неодинаковая проводимость между образцом и буферным раствором, длина блока

ввода проб, размер ячейки детектора и расположение резервуаров с буферными растворами

на разных уровнях, также могут вносить значительный вклад в дисперсию полос.

Разделение между двумя полосами (выражаемое как разрешение, R

) может быть получено

путем изменения электрофоретической подвижности растворенных веществ,

электроосмотической подвижности, индуцированной в капилляре, и путем увеличения

эффективности полосы для каждого определяемого вещества согласно уравнению:

где:

еpa

и µ

еpb

– электрофоретическая подвижность двух разделенных веществ;

еp

– средняя электрофоретическая подвижность двух растворенных веществ

еp





(µ

еpb

еpa

ПРИБОР

Прибор для капиллярного электрофореза состоит из:

 регулируемого высоковольтного источника питания постоянного тока;

 двух резервуаров с буферными растворами, расположенных на одном уровне и содержащих

указанные анодные и катодные растворы;

 двух электродов (катод и анод), погруженных в резервуары с буферными растворами и

соединенных с источником питания;

 разделительного капилляра (обычно изготовленного из плавленого кварца), который, при

использовании с некоторыми конкретными типами детекторов, имеет оптическое

смотровое окно, совмещенное с детектором. Концы капилляра помещают в резервуары с

буферными растворами. Капилляр заполняют раствором, указанным в частной

монографии;

 подходящей системы ввода проб;

 детектора, способного контролировать количество определяемых веществ, проходящих

через сегмент разделительного капилляра в течение определенного времени; обычно

основанный на абсорбционной спектрофотометрии (в ультрафиолетовой и видимой

областях) или флуориметрии, также в ряде случаев может быть использовано

кондуктометрическое, амперометрическое или масс-спектрометрическое детектирование;

альтернативным способом, используемым для обнаружения соединений, не поглощающих

УФ-излучение и не флуоресцирующих, является непрямое детектирование;

 термостатической системы, способной поддерживать постоянную температуру внутри

капилляра для получения воспроизводимых результатов разделения;

 регистратора и подходящего интегратора или компьютера.

Для точного количественного анализа процесс ввода проб и его автоматизация имеют

критическое значение. Ввод пробы может быть основан на использовании гравитации,

давления или вакуума и электрокинетической силы. Количество каждого компонента

образца, вводимого электрокинетическим способом, зависит от его электрофоретической

подвижности, что приводит к возможным неравным условиям при использовании данного

режима ввода проб.

Используют капилляр, буферные растворы, предварительную подготовку, испытуемый

раствор и условия миграции, описанные в частной монографии для испытуемого вещества.

Используемый раствор электролита фильтруют для удаления частиц и дегазируют, чтобы

избежать образования пузырьков, которые могут помешать работе детектора или прервать

электрический контакт в капилляре во время разделительного прогона. Для достижения

воспроизводимых значений времени миграции растворов должна быть разработана

процедура тщательной промывки для каждой аналитической методики.

КАПИЛЛЯРНЫЙ ЗОННЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

ПРИНЦИП

В капиллярном зонновом электрофорезе испытуемые образцы разделяются в капилляре,

содержащем только буферный раствор без какой-либо противоточной среды. При

использовании этого метода разделение в виде дискретных полос происходит потому, что

различные компоненты образца мигрируют с разной скоростью. Скорость перемещения

каждой полосы зависит от электрофоретической подвижности растворенного вещества и

электроосмотического потока в капилляре (см. раздел «Общие принципы»). Капилляры с

покрытием могут быть использованы для увеличения разделительной способности веществ,

адсорбирующихся на поверхности плавленого кварца.

При использовании данного вида капиллярного электрофореза можно проводить анализ как

малых (M

<2000), так и больших молекул (2000 < M

<100000). Благодаря высокой

эффективности капиллярного зонного электрофореза может быть осуществлено разделение

молекул, имеющих лишь незначительные различия в величинах их отношений заряда к

массе. Этот разделительный способ также позволяет разделять хиральные соединения путем

добавления хиральных селекторов в буферный раствор для разделения.

ОПТИМИЗАЦИЯ

Оптимизация разделения является комплексным процессом, в котором основную роль могут

играть несколько параметров разделения. Основными факторами, которые необходимо

учитывать при разработке разделения, являются инструментальные параметры и параметры

раствора электролита.

Инструментальные параметры

Напряжение. Для оптимизации прилагаемого напряжения и температуры капилляра

пригоден график Джоулева нагрева. Время разделения обратно пропорционально

приложенному напряжению. Однако увеличение напряжения может вызвать избыточное

выделение тепла, что приводит к повышению температуры и, как результат, образование

градиентов вязкости в буферном растворе внутри капилляра. Этот эффект вызывает

расширение полосы и уменьшает разрешение.

Полярность. Полярность электродов может быть нормальной (анод на входе и катод на

выходе), электроосмотический поток при этом перемещается по направлению катода. В

случае обращенной полярности электродов электроосмотический поток направлен от выхода

из капилляра, и только заряженные растворенные вещества с электрофоретической

подвижностью, превышающей электроосмотический поток, будут проходить к выходу.

Температура. Температура оказывает основное влияние на вязкость буферного раствора и

электропроводность, а, следовательно, на скорость миграции. В некоторых случаях

повышение температуры в капилляре может вызвать конформационные изменения в белках,

изменяя время их миграции и эффективность разделения.

Капилляр. Размеры капилляра (длина и внутренний диаметр) влияют на время анализа,

эффективность разделения и производительность. Увеличение как эффективной длины, так и

общей длины капилляра может уменьшить электрические поля (работающие при постоянном

напряжении), что увеличивает время миграции. Для определенного буферного раствора и

электрического поля рассеивание тепла и, следовательно, расширение полосы образца,

зависит от внутреннего диаметра капилляра. Последнее также влияет на предел обнаружения,

зависящий от объема вводимой пробы и используемой системы обнаружения.

Поскольку адсорбция компонентов испытуемого образца на стенке капилляра ограничивает

эффективность, при разработке методики разделения следует рассмотреть способы,

позволяющие избежать этих взаимодействий. В конкретном случае с белками было

разработано несколько способов, позволяющих избежать адсорбции на стенке капилляра.

Некоторые из этих способов (использование экстремальных значений рН и адсорбция

положительно заряженных буферных добавок) требуют только модификации состава буфера

для предотвращения адсорбции белка. В других способах внутреннюю стенку капилляра

покрывают полимером, ковалентно связанным с поверхностью, что предотвращает

взаимодействие между белками и отрицательно заряженной поверхностью кварца. Для этих

целей используют готовые к применению капилляры с покрытиями, состоящими из

нейтрально-гидрофильных, катионных и анионных полимеров.

Параметры раствора электролита

Тип и концентрация буферного раствора. Буферные растворы, подходящие для

капиллярного электрофореза, имеют соответствующую буферную емкость в выбранном

диапазоне значений pH и низкую подвижностью для минимизации образования тока. Подбор

во всех возможных случаях буферного иона с подвижностью, соответствующей подвижности

растворенного вещества, важен для минимизации искажения полосы.Соответствие

подвижности ионов буфера и подвижности растворенного вещества, когда это возможно,

важно для минимизации искажения полосы. Тип используемого растворителя для

испытуемого образца также важен для достижения фокусирования вещества на колонке, что

повышает эффективность разделения и улучшает детектирование.

Увеличение концентрации буферного раствора (для данного значения pH) уменьшает

электроосмотический поток и скорость миграции растворенного вещества.

Значение pH буферного раствора. Значение рН буферного раствора может влиять на

разделение, изменяя заряд испытуемого вещества или добавок, а также электроосмотический

поток. При разделении белков и пептидов изменение pH буферного раствора от значения,

превышающего изоэлектрическую точку (pI) до значения меньше ее, изменяет суммарный

заряд растворенного вещества с отрицательного на положительный. Увеличение рН буфера

обычно увеличивает электроосмотический поток.

Органические растворители. К водным буферным растворам для увеличения растворимости

веществ или других добавок и/или для воздействия на степень ионизации компонентов

образца могут быть добавлены органические модификаторы (метанол, ацетонитрил и т. д.).

Добавление таких органических модификаторов к буферному раствору обычно вызывает

уменьшение электроосмотического потока.

Добавки для хиральных разделений. Для разделения энантиомеров к разделяющему

буферному раствору добавляют хиральный селектор. Наиболее часто используемыми

хиральными селекторами являются циклодекстрины, но также могут использоваться краун-

эфиры, полисахариды и белки. Поскольку хиральное распознавание определяется

различными взаимодействиями между хиральным селектором и каждым из энантиомеров,

разрешение, достигаемое для хиральных соединений, во многом зависит от типа

используемого хирального селектора. В связи с этим при разработке данных методик

разделения может оказаться полезным испытание с циклодекстринами с разным размером

полостей (α-, β- или γ-циклодекстрин) или модифицированными циклодекстринами с

нейтральными (метил-, этил-, гидроксиалкил- и другие) или способными к ионизации

(аминометил-, карбоксиметил-, сульфобутиловый эфир и другие) группами. При

использовании модифицированных циклодекстринов необходимо учитывать различия в

степени замещения циклодекстринов между разными партиями данных веществ, поскольку

это может влиять на селективность. Другими факторами, контролирующими разрешение при

хиральных разделениях, являются концентрация хирального селектора, состав и значение рН

буферного раствора, а также температура. Достигнутую величину разрешения также может

изменять использование органических добавок, таких как метанол или мочевина.

КАПИЛЛЯРНЫЙ ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

ПРИНЦИП

В капиллярном гель-электрофорезе разделение происходит внутри капилляра, заполненного

гелем, действующим как молекулярное сито. Разделение молекул с одинаковыми величинами

отношения заряда к массе происходит в соответствии с размером молекул, поскольку более

мелкие молекулы легче проникают в структуру геля и, поэтому, мигрируют быстрее, чем

более крупные молекулы. Таким образом, с помощью капиллярного гель-электрофореза

различные биологические макромолекулы (например, белки и фрагменты ДНК), часто

имеющие близкие величины отношения заряда к массе, могут быть разделены по их

молекулярной массе.

ХАРАКТЕРИСТИКИ ГЕЛЕЙ

В капиллярном электрофорезе используют гели двух типов: гели химически

модифицированные и гели динамически модифицированнные. Химически

модифицированные гели, такие как поперечно-сшитый полиакриламид, получают путем

полимеризации мономеров внутри капилляра. Обычно они связаны с поверхностью стенки

плавленого кварца и не могут быть удалены без разрушения капилляра. Если гели

используют для анализа белка в восстанавливающих условиях, разделяющий буферный

раствор обычно содержит натрия додецилсульфат, а испытуемые образцы перед вводом

денатурируют нагреванием в смеси натрия додецилсульфата и 2-меркаптоэтанола или

дитиотреитола. При использовании не восстанавливающих условий (например, анализ

интактного антитела) 2-меркаптоэтанол и дитиотреитол не применяют. Разделение на

поперечно -сшитых гелях может быть оптимизировано изменением разделяющего буферного

раствора (в соответствии с указаниями в разделе капиллярный зонный электрофорез) и

контролем пористости геля во время его приготовления. Пористость поперечно - сшитых

полиакриламидных гелей может быть модифицирована путем изменения концентрации

акриламида и/или пропорции сшивающего реагента. Как правило, уменьшение пористости

геля приводит к уменьшению подвижности растворенных веществ. Из-за жесткости этих

гелей может быть использован только электрокинетический ввод пробы.

Динамически модифицированные гели представляют собой гидрофильные полимеры, такие

как линейный полиакриламид, производные целлюлозы, декстран и другие, способные

растворяться в водных разделяющих буферных растворах, образуя разделительную среду,

которая также действует как молекулярное сито. Такие разделяющие среды легче

приготовить, чем поперечно - сшитые полимеры. Они могут быть приготовлены во флаконе и

заполнены под давлением в капилляр с модифицированной поверхностью (без

электроосмотического потока). Замена геля перед каждым вводом пробы обычно улучшает

воспроизводимость разделения. Пористость гелей может быть увеличена при использовании

полимеров с большей молекулярной массой (при заданной концентрации полимера) или

путем уменьшения концентрации полимера (при определенной молекулярной массе

полимера). Уменьшение пористости геля приводит к уменьшению подвижности

растворенного вещества для того же буферного раствора. Поскольку при растворении этих

полимеров в буферном растворе образуются растворы с низкой вязкостью, может быть

использован как гидродинамический, так и электрокинетический ввод пробы.

КАПИЛЛЯРНОЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ

ПРИНЦИП

При изоэлектрическом фокусировании молекулы мигрируют под действием электрического

поля, до тех пор пока они заряжены в градиенте рН, создаваемом амфолитами, имеющими

широкий диапазон значения pI (полиаминокарбоновые кислоты), растворенными в

разделяющем буферном растворе. Тремя основными стадиями изоэлектрической

фокусирования являются загрузка, фокусирование и мобилизация.

Стадия загрузки. Могут быть использованы два способа:

– загрузка в один прием (одноступенчатая загрузка): испытуемый образец смешивают с

амфолитами и вводят в капилляр либо под давлением, либо под вакуумом ;

– последовательная загрузка : в капилляр вводят ведущий буферный раствор, затем

амфолиты, затем испытуемый образец, смешанный с амфолитами, после чего снова только

амфолиты и, наконец, завершающий буферный раствор. Объем образца должен быть

достаточно мал, чтобы не влиять на величину градиента рН.

Стадия фокусирования. При подачи напряжения амфолиты в зависимости от их

суммарного заряда мигрируют к катоду или аноду, создавая таким образом градиент pH от

анода (более низкий pH) к катоду (более высокий

pH). На данной стадии разделяемые компоненты мигрируют до тех пор, пока не достигнут

значения рН, соответствующего их изоэлектрической точке (pI), и ток не упадет до очень

низких значений.

Стадия мобилизации. Если для обнаружения требуется мобилизация, используют один из

следующих способов:

– в первом способе мобилизация осуществляется на стадии фокусирования под действием

электроосмотического потока; электроосмотический поток должен быть достаточно малым,

чтобы позволить фокусирование компонентов;

– во втором способе мобилизация осуществляется после стадии фокусирования путем

приложения положительного давления;

– в третьем способе мобилизация достигается после стадии фокусирования путем добавления

солей в катодный резервуар или анодный резервуар (в зависимости от выбранного

направления мобилизации) для изменения рН в капилляре при наложении напряжения. При

изменении рН белки и амфолиты перемещаются по направлению к резервуару, содержащего

добавленные соли, и проходят через детектор.

Достигнутое разделение, выраженное как ΔpI, зависит от градиента pH (dpH/d

), количества

амфолитов, имеющих разные величины pI, коэффициента молеку-лярной диффузии (D),

напряженности электрического поля (E) и изменения электрофоретической подвижности

испытуемого вещества при изменении рН (- d

/dpH):

ОПТИМИЗАЦИЯ

Основными параметрами, которые необходимо учитывать при разработке методик

разделения, являются:

Напряжение. В капиллярном изоэлектрическом фокусировании на стадии фокусирования

используют очень сильные электрические поля от 300 В/см до 1000 В/см.

Капилляр. В зависимости от способа мобилизации (см. выше) электроосмотический поток

должен быть уменьшен или подавлен. Капилляры с модифицированной поверхностью, как

правило, уменьшают электроосмотический поток.

Растворы. Резервуар с анодным буферным раствором заполняют раствором со значением pH

меньше значения pI наиболее кислотного амфолита, а катодный резервуар заполняют

раствором со значением pH больше значения pI самого основного амфолита. Для анодных

буферных растворов часто используют кислоту фосфорную, а для катодных - натрия

гидроксид.

Добавление полимера, такого как метилцеллюлоза, в раствор амфолита приводит к

подавлению конвективных сил (если такие имеются) и электроосмотического потока за счет

увеличения вязкости. Доступны коммерческие амфолиты, охватывающие многие диапазоны

рН, и при необходимости для получения расширенного диапазона рН их можно смешивать.

Широкие диапазоны pH используются для оценки величины изоэлектрической точки, тогда

как более узкие диапазоны используются для повышения точности. Для калибровки можно

использовать зависимость между временем миграции и изоэлектрической точкой для серии

белковых маркеров. При необходимости, осаждение белков во время стадии фокусирования в

их изоэлектрической точке можно предотвратить с помощью буферных добавок, таких как

глицерин, поверхностно-активные вещества, мочевина или цвиттер - ионные буферные

растворы. Следует иметь в виду, что мочевина в зависимости от концентрации денатурирует

белки.

МИЦЕЛЛЯРНАЯ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (МЭКХ)

ПРИНЦИП

В мицеллярной электрокинетической хроматографии разделение происходит в растворе

электролита, который содержит поверхностно-активное вещество в концентрации,

превышающей критическую концентрацию мицеллобразования (ккм). Молекулы

растворенного вещества распределяются между водным буферным раствором и

псевдонеподвижной фазой, образованной мицеллами, в соответствии с коэффициентом

распределения растворенного вещества. Таким образом, этот метод можно рассматривать как

гибрид электрофореза и хроматографии. Он может быть использован для разделения как

нейтральных, так и заряженных растворенных веществ, сохраняя при этом эффективность,

скорость и оборудование присущие капиллярному электрофорезу. Одним из наиболее

широко используемых поверхностно-активных веществ в мицеллярной электрокинетической

хроматографии является анионное поверхностно-активное вещество натрия додецилсульфат,

используются также и другие поверхностно-активные вещества, например катионные

поверхностно-активные вещества, такие как соли цетилтриметиламмония.

Механизм разделения заключается в следующем. При нейтральном и щелочном значении pH

создается сильный электроосмотический поток, который перемещает ионы разделяющего

буферного раствора в направлении катода. Если в качестве поверхностно-активного вещества

используют натрия додецилсульфат, электрофоретическая миграция анионной мицеллы

происходит в противоположном направлении, к аноду. В результате общая скорость

миграции мицелл уменьшается по сравнению со скоростью потока раствора электролита. В

случае нейтральных растворенных веществ скорость миграции испытуемого вещества будет

зависеть только от коэффициента распределения между мицеллой и водным буферным

раствором, поскольку испытуемое вещество может распределяться между мицеллой и

водным буферным раствором, не обладая электрофоретической подвижностью. На

электрофореграмме пики, соответствующие каждому из разделяемых незаряженных

растворенных веществ, всегда находятся между пиком маркера электроосмотического потока

и пиком мицеллы (время, прошедшее между этими двумя пиками, называется окном

разделения). Для электрически заряженных растворенных веществ скорость миграции

зависит как от коэффициента распределения растворенного вещества между мицеллой и

водным буферным раствором, так и от электрофоретической подвижности растворенного

вещества в отсутствие мицеллы. Поскольку механизм мицеллярной электрокинетической

хроматографии нейтральных и слабоионизированных растворенных веществ в основном

является хроматографический, миграция растворенного вещества и разрешение могут быть

охарактеризованы с помощью коэффициента удерживания растворенного вещества (k′),

также известного как концентрационный коэффициент массового распределения (D

который представляет собой отношение числа молей растворенного вещества в мицелле к

количеству молей растворенного вещества в подвижной фазе. Для нейтрального соединения k

′ определяется как:

где:

N – число теоретических тарелок для одного из растворенных веществ;



– селективность;

′ и k

′ – коэффициенты удерживания для обоих растворенных веществ,

соответственно (k

′  k

′).

Подобные, но неидентичные уравнения для значений k′ и R

используют и для электрически

заряженных растворенных веществ.

ОПТИМИЗАЦИЯ

где:



время миграции растворенного вещества;



время анализа неудержанного растворенного вещества (определяется с помощью

маркера электроосмотического потока, не входящего в мицеллу, например, метанола);



время миграции мицеллы (измеряется с помощью маркера мицеллы, такого как Судан

III, который мигрирует, будучи постоянно связанным с мицеллой);



коэффициент распределения растворенного вещества;



объем мицеллярной фазы;



объем подвижной фазы.

Аналогично, разрешение между пиками двух близко мигрирующих растворенных веществ (R

)

определяется как:

Основными параметрами, которые необходимо учитывать при разработке методик

разделения методом мицеллярной электрокинетической хроматографии, являются параметры

прибора и раствора электролита.

Инструментальные параметры

Напряжение. Время разделения обратно пропорционально приложенному напряжению.

Однако увеличение напряжения может вызвать избыточное выделение тепла, что приводит к

возникновению градиентов температуры и вязкости буферного раствора в поперечном

сечении капилляра. Данный эффект может быть значительным при использовании буферных

растворов с высокой электропроводностью и содержащих мицеллы. Недостаточное

выделение тепла приводит к расширению полосы и уменьшению разрешения.

Температура. Изменения температуры капилляра влияют на коэффициент распределения

растворенного вещества между буферным раствором и мицеллами, критическую

концентрацию мицелл и вязкость буферного раствора. Эти параметры влияют на время

миграции растворенных веществ. Использование надлежащей системы охлаждения улучшает

воспроизводимость времени миграции растворенных веществ.

Капилляр. Как и в случае капиллярного зонного электрофореза, размеры капилляра (длина и

внутренний диаметр) влияют на время испытания и эффективность разделения. Увеличение

как эффективной длины, так и общей длины капилляра может ослабить электрические поля

(работающие при постоянном напряжении), увеличить время миграции и улучшить

эффективность разделения. Внутренний диаметр контролирует рассеивание тепла (для

определенного буферного раствора и электрического поля) и, соответственно, расширение

полосы испытуемого образца.

Параметры раствора электролита

Тип и концентрация поверхностно–активного вещества. Тип поверхностно-активного

вещества, как и неподвижная фаза в хроматографии, влияет на разрешение, поскольку

изменяет селективность разделения. Кроме того, lоg k′ нейтрального соединения линейно

увеличивается с концентрацией поверхностно-активного вещества в подвижной фазе.

Поскольку разрешение в мицеллярной электрокинетической хроматографии достигает

максимума при приближении величины k′ к значению изменение концентрации

поверхностно-активного вещества в подвижной фазе изменяет величину разрешения.

рН буферного раствора. Несмотря на то, что значение pH не изменяет коэффициент

распределения неионизированных растворенных веществ, оно может изменять

электроосмотический поток в капилляре с немодифицированной поверхностью. Уменьшение

значения рН буферного раствора уменьшает электроосмотический поток и тем самым

увеличивает разрешение нейтральных растворенных веществ в мицеллярной

электрокинетической хроматографии, что приводит к увеличению времени анализа.

Органические растворители. Для улучшения мицеллярной электрокинетической

хроматографии – разделения гидрофобных соединений в раствор электролита могут быть

добавлены органические модификаторы (метанол, пропанол, ацетонитрил и др.). Добавление

этих модификаторов обычно уменьшает время миграции и селективность разделения.

Поскольку добавление органических модификаторов влияет на величину критической

концентрацию мицеллообразования, данную концентрацию поверхностно-активного

вещества можно использовать только в пределах определенного процентного содержания

органического модификатора до прекращения мицеллообразования или отрицательного

влияния на этот процесс, приводящего к исчезновению мицелл и прекращению разделения.

Диссоциация мицелл в присутствии большого количества органического растворителя не

всегда означает невозможность дальнейшего разделения; в некоторых случаях гидрофобное

взаимодействие между мономером ионного поверхностно-активного вещества и

нейтральными растворенными веществами приводит к образованию сольвофобных

комплексов, которые могут быть разделены электрофоретически.

Добавки для хиральных разделений. Для разделения энантиомеров с использованием

мицеллярной электрокинетической хроматографии в мицеллярную систему включают

хиральный селектор, либо ковалентно связанный с поверхностно-активным веществом, либо

добавляемый в раствор электролита, в котором происходит разделение мицелл. Мицеллы,

имеющие фрагмент со свойствами хиральной дискриминации, включают соли N -

додеканоил- 1 - аминокислот, соли желчных кислот и т. д. Хиральное разделение также

может быть достигнуто с помощью циклодекстринов, добавленных к растворам электролитов

и содержащих мицеллы ахиральных поверхностно-активных веществ.

Другие добавки. Существует несколько подходов для изменения селективности путем

добавления химических веществ к буферному раствору. Добавление нескольких типов

циклодекстринов к буферному раствору также может быть использовано для уменьшения

взаимодействия гидрофобных растворенных веществ с мицеллой, тем самым повышая

селективность для такого типа соединения.

Добавление веществ, способных изменять взаимодействие между растворенным веществом и

мицеллой за счет адсорбции на последней, используется для повышения селективности

разделения в мицеллярной электрокинетической хроматографии. Данные добавки могут

представлять собой второе поверхностно-активное вещество (ионное или неионное),

приводящее к образованию смешанных мицелл или катионов металлов, которые

растворяются в мицелле и образуют координационные комплексы с растворенными

веществами.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Чтобы получить скорректированную площадь, площади пиков должны быть разделены

соответствующими временами миграции, позволяющими компенсировать:

– смещение времен миграции от прогона к прогону, тем самым уменьшая вариации отклика;

– различные отклики компонентов испытуемого образца с различными временами миграции.

При использовании внутреннего стандарта следует убедиться в том, что ни один пик

испытуемого вещества не перекрывается пиком внутреннего стандарта.

РАСЧЕТЫ

По полученным данным рассчитывают содержание испытуемого компонента или

компонентов. Если указано, рассчитывают процентное содержание одного или нескольких

компонентов испытуемого образца путем определения скорректированной(ых) площади(ей)

пика(ов) в процентах от суммы скорректированных площадей всех пиков, исключая пики,

соответствующие растворителям или любым добавленным реактивам (метод нормализации).

Рекомендуется использование автоматической системы интегрирования (интегратора или

системы получения и обработки данных).

ПРИГОДНОСТЬ СИСТЕМЫ

Параметры пригодности системы используют для проверки поведения системы капиллярного

электрофореза. Выбор этих параметров зависит от используемого вида капиллярного

электрофореза. К ним относятся: коэффициент удерживания (k′) (только для мицеллярной

электрокинетической хроматографии), число теоретических тарелок (N), коэффициент

симметрии (A

) и разрешение (R

). В предыдущих разделах были описаны уравнения для

расчетов N и R

, ниже приведены уравнения, позволяющие рассчитать эти параметры из

электрофореграмм.

ЧИСЛО ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ТАРЕЛОК

Число теоретических тарелок (N) может быть рассчитано по формуле:

где:

– время миграции или расстояние по базовой линии от точки ввода пробы до

перпендикуляра, опущенного из максимума пика, соответствующего компоненту;

– ширина пика на половине высоты.

РАЗРЕШЕНИЕ

Разрешение ( R

) между пиками одинаковой высоты двух компонентов может быть

рассчитано по формуле:

 t

где:

и t

R2 –

времена миграции или расстояния вдоль базовой линии от точки

линии от ввода проб до перпендикуляров, опущенных из максимумовов двух соседних

двух соседних пиков;

и w

 ширина пика на половине высоты.

При необходимости разрешение способность может быть рассчитано путем измерения

высоты впадины (H

) между двумя частично разделенными пиками в стандартном образце и

высоты меньшего пика (H

) и расчета отношения пик/впадина:

КОЭФФИЦИЕНТ СИММЕТРИИ

Коэффициент симметрии пика (As) рассчитывают по формуле:

где:

0.05



ширина пика на одной двадцатой его высоты;



расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика и передней

границей пика на одной двадцатой его высоты.

Испытания на повторяемость площади (стандартное отклонение площадей или отношений

площадь/время миграции) и времен миграции (стандартное отклонение времени миграции)

используют в качестве параметров пригодности. Повторяемость времени миграции

обеспечивает испытание пригодности процедуры промывки капилляра. Альтернативным

способом, позволяющим избежать ухудшения воспроизводимости времени миграции,

является использование времени миграции относительно времени миграции внутреннего

стандарта. Для определения родственных примесей может быть полезно испытание на

проверку отношения сигнал/шум для стандартного образца (или определение предела

количественного определения).

ОТНОШЕНИЕ СИГНАЛ-ШУМ

Предел обнаружения и предел количественного определения соответствуют отношениям

сигнал/шум, равным 3 и 10 соответственно. Отношение сигнал/шум (S/N) рассчитывают по

формуле:











где:

H – высота пика рассматриваемого компонента на электрофореграмме указанного

раствора сравнения, измеренная от максимума пика до экстраполированной

базовой линии сигнала, наблюдаемого на расстоянии, равном двадцатикратной

ширине на половине его высоты;

h – область фонового шума на электрофореграмме, полученной после введения

контрольного раствора, наблюдаемая на расстоянии, равном двадцатикратной

ширине пика на половине его высоты на электрофореграмме указанного раствора

сравнения, и, по возможности, расположенная по обе стороны от места

возможного обнаружения пика.